肖述，符政君，張躍環，喻子牛
（中國科學院湛江海洋經濟動物實驗站 廣東 湛江 524001）
摘要：對我國南方海域分布的熊本牡蠣人工繁育技術研究結果表明：熊本牡蠣繁育周期較香港牡蠣長，每年4月到10月共6個月繁殖時長；幼蟲培育以單一云微藻全程投喂，各階段發育正常，并最終能完成正常變態；熊本牡蠣對苗種繁育密度具有較高敏感性，6日齡前（殼高低于150µ）繁育密度以10個/ml實驗組生長最快（殼高148.22µ±6.98）、成活率最高(68.43%±13.56)，殼頂中后期以密度為5個/ml實驗組表現最佳；鹽度實驗表明，熊本牡蠣具有廣鹽性，15ppt-30ppt都可以進行該牡蠣苗種繁育，生長與成活率結果表明最適鹽度為20-25ppt。
關鍵詞：熊本牡蠣；人工繁育；鹽度；密度
熊本牡蠣（Crassostreasikamea）在分類上屬于軟體動物門（Mollusca）、瓣鰓綱（Lamellibranchia）、翼形亞綱（Pterimorpjia）、珍珠貝目（Pterioida）、牡蠣科（Ostreidae）、巨蠣屬（Crassostrea）。該牡蠣曾經被認為是長牡蠣（C.gigas）的一個地理亞種；后來通過雜交親和試驗、細胞染色體技術、同工酶技術等初步認定熊本牡蠣應當歸類為獨立物種[5,7]；借助分子標記技術的發展進一步厘清了熊本牡蠣的分類地位[6]。熊本牡蠣是一種廣溫、廣鹽性經濟型種類，長期被錯誤認為只存在于日本（日本南部九州島嶼的熊本縣有明海灣）。此后有部分學者推測韓國以及我國部分海域均有分布[11]?，F已證實該牡蠣我國主要分布區為廣東、江蘇、廣西以及福建等地[1,3,8,10]。
熊本牡蠣不僅肉質鮮美、營養豐富，市場價值高，而且具有不同于其它牡蠣的優良特性——產品上市不受性腺發育影響，可填補牡蠣繁殖季節市場優質產品的空缺。但因該牡蠣個體較小，產量較低，在我國重視產量的年代一直未能引起足夠關注，有關熊本牡蠣苗種繁育的研究工作屈指可數[2-3]。本世紀初，熊本牡蠣養殖在美國已得到產業化發展，產品滿足其國內市場的同時甚至出口到了日本。2008年日本亦開始了苗種人工繁育和規?；B殖工作，冀望將熊本牡蠣打造成其特色養殖產業[11]。隨著國際同行對該牡蠣價值的進一步挖掘，同時國內市場對稀缺性高品質牡蠣的擴大需求，熊本牡蠣苗種繁育及規?；a等相關研究工作在國內顯得重要而迫切。特別是近年來北方太平洋牡蠣深受夏季死亡困擾，廣東、廣西的香港牡蠣種類也常在冬末春初遭遇不明原因大規模死亡，此種背景下，發展熊本牡蠣的人工繁殖技術研究對于優化牡蠣產品結構、提升產品價值、保護牡蠣產業均衡、穩定發展等都具有十分重要的意義。本研究詣在探索性展開人工育苗實踐，為后續全面展開熊本牡蠣工廠化人工繁育及其相關研究工作提供參考。
1. 材料與方法
1.1 親貝收集與性腺同步促熟
分別于2012年4月、7月、10月在湛江坡頭區乾塘鎮三窩收集熊本牡蠣親本每次約30kg。2個小時內將親本移往湛江東海島“中科院熱帶海洋經濟動物實驗站—東南實驗基地”。經表面清洗干凈后，挑選優質個體籠養于室內水泥池促熟。每次選用親本約100個，親本殼高范圍4.5-6.8cm，殼長3.4-4.2cm。促熟期間，采用自然海水，水溫28.0—30.0℃，鹽度25—26ppt，pH為7.5—8.2，投喂混合單細胞餌料（云微藻Chlorella sp.、金藻Isochrysis zhangjiangensis、角毛藻Chaetoceros sp），其它按照正常管理。
1.2 受精、孵化
在室內水泥池中經性腺同步化培育7天，解剖法受精，卵細胞經過500目篩絹網過濾，除去破碎的組織塊團，置于50L事先處理好的鹽度梯度海水中(溫度：30℃；pH：8.1)，浸泡10-20分鐘后（具體浸泡時間依卵細胞成熟度來判斷）。然后解剖雄性個體，精子活化5分鐘后進行人工授精。并在鹽度25ppt、溫度30℃條件下進行受精、孵化。
1.3 密度與鹽度梯度培養
1.3.1密度梯度培養
孵化出的幼蟲，部分以5、10、15、20個/ml 的幼蟲培育密度培養于100L聚乙烯白桶，設置3個重復。全程投喂云微藻（Chlorella sp.）。
1.3.2鹽度梯度培養
另一部分幼蟲置于4個不同鹽度梯度培養系統中，鹽度設置分別為15、20、25、30ppt。實驗均在100L白色聚乙烯桶中進行，每個鹽度驗設置3個重復組。幼蟲進入15ppt系統前經20ppt過渡培養1天避免鹽度差異太大導致結果偏差。
1.4 測定指標
受精以釋放極體為統計依據計算受精率；孵化率為D形幼蟲數與受精卵數量的百分比；幼蟲存活率為每次測量存活個體數與D形幼蟲數的比值；變態率為稚貝數與足面盤幼蟲數量的比值。幼蟲的殼高在10×目微尺下測量，測量時每次隨機抽取30個個體。
1.5 數據處理
用SPSS16.0統計軟件對數據進行分析處理，不同實驗組間數據的比較采用單因素方差分析方法（LSD），差異顯著性設置為P＜0.05。
2. 結果
2.1 受精、孵化
熊本牡蠣剛解剖出的卵呈梨形，經20min浸泡成熟后，卵徑大小為50±2.15μm。孵化水溫30.5℃、鹽度25ppt。經15h發育成D形幼蟲，消化系統開始發育，20h后顯微鏡觀察可見體內消化系統發育充分，表明可以開口投喂。2012年4-10月份范圍3次（4月、7月、10月）人工繁育均獲得成功，且受精與胚胎發育正常。胚胎發育過程及其變化特征見表1、孵化及幼蟲存活結果見表2。
表1熊本牡蠣的胚胎及胚后發育
表2 孵化、變態及存活
2.2培育密度對幼蟲生長及存活的影響
不同的培育密度（5、10、15、20）下，d=20個/ml實驗組幼蟲生長顯著小于其它密度組（P＜0.05），6日齡內d=10個/ml密度組幼蟲生長最快（殼高148.22µ±6.98），但與d=5個/ml、d=15個/ml的實驗組幼蟲生長差異不顯著（P＞0.05）（圖1）。9日齡后d=5個/ml實驗組生長最快。相比生長速度，密度對幼蟲存活率影響更大，從殼頂期影響尤其顯著：5-15個/ml實驗組存活率顯著高于20個/ml實驗組（P＜0.05），其中，d=10個/ml組9日齡成活率高達68.43%±13.56，d=2 0個/ml 實驗組在12齡殼頂后期全部死亡，未能發育至變態階段（圖2）。d=5實驗組，15日齡時成活率最高（36.88%±9.88）。
圖1 示不同密度對幼蟲生長（殼高）影響
圖2 示不同密度對幼蟲成活率（%）影響
2.3鹽度梯度對幼蟲生長（殼高）與存活的影響
spss多重比較結果如表3，可以看出不同鹽度組生長速度存在差異，20ppt、25ppt兩個處理組生長較快，兩組內無顯著差異，但與15ppt、30ppt鹽度組存在顯著差異（見表內同行間字母差異）。從表4看出不同鹽度處理下成活率差異，15ppt、20ppt、25ppt成活率較高，3日齡成活率20ppt試驗組達95.32%，成活率最高；9日齡成活率25ppt試驗組最大（成活率為81.77%）；15日齡成活率20ppt試驗組最大（成活率為73.85%），從表可看出，15日齡成活率最差的為15ppt組，僅為50.55%。
表3. 不同鹽度處理組幼蟲殼高生長
表4. 不同鹽度處理組幼蟲存活率%（×100）
3. 討論
廣東海域熊本牡蠣性腺發育較香港牡蠣早，每年3月份性腺開始發育，4月份可產卵，一年內可多次產卵，每年繁殖周期長達6個月之久（廣東每年4月到10月）。但為保證性腺的同步性，在其性腺發育中后期階段進行室內營養強化，對后期苗種繁育十分有利。營養強化手段與其它牡蠣差別不大。精、卵質量對受精率影響較大，胚胎發育早期相比我國太平洋牡蠣與香港牡蠣略微快速。該牡蠣個體較小致絕對懷卵量較小，生產性大規模繁育時，需要親本數量大。4月、7月、10月三次育苗實驗都獲得成功，預示該牡蠣在我國南海地區性腺恢復快，可多4-10月范圍內多批次進行人工繁育。另外本實驗中全程投喂單一云微藻，未發現熊本牡蠣幼蟲明顯不適現象，這對我國南方高溫多雨、難以培養金藻的地區而言，具有十分重要意義。
熊本牡蠣人工繁育密度對苗種繁育成敗非常重要。6日齡前，苗種培育密度從5-20個/ml各密度組都對生長存活無顯著影響，早期高密度組生長略好于低密度組，但均無顯著差異，這種高密度組生長以及養殖系統穩定性好于低密度組現象，可能與牡蠣聚群生態特性有關，因牡蠣個體?。ㄔ缙趦H60-70µ），因此對環境變化適應能力可能部分依賴于群體大小與密度狀況，這在其它貝類的生產實踐中也時常有類似發現。但隨個體增大（殼高超過150µ），低密度組d=5個/ml逐漸體現出生長優勢，成活率高密度組d=20在12日齡階段死亡率超過95%，可能原因是南方水溫較高，隨個體快速生長，養殖系統內代謝物含量急劇上升，極容易導致病害爆發，常短時間內就會出現幼蟲下沉、死亡現象。因此綜合驗結果，未來苗種生產在D形階段可采用高密度培養(d=10)，進入殼頂階段，逐漸降低密度到d=5，最后殼頂后期、眼點期，可將密度進一步降低。我們隨后的鹽度梯度實驗，采用不同發育階段密度從10個/ml逐步調整到1-2個/ml，15日齡成活率在各鹽度梯度下均得到明顯提高。
該牡蠣具有廣鹽性，幼蟲階段對鹽度的適應性反映了其自然分布海區的鹽度特點，在我國沿海與香港牡蠣、太平洋牡蠣、福建牡蠣均存在生態位部分重疊，其最適鹽度分布區域應介于香港牡蠣與另兩種牡蠣之間。鹽度梯度實驗顯示在15ppt到30ppt都可進行人工繁育，生長和成活率結果都表明20ppt、25ppt是熊本牡蠣最適鹽度，其次為30ppt鹽度組，成活率最差為15ppt實驗組，該結果與國外學者研究結論相似[9]。鹽度實驗部分，為了獲得相對穩定的實驗結果，我們在不同發育階段進行了幼蟲密度調整，各梯度內始終保持了培養密度一致，因此不會對實驗結論造成干擾，但提高了本實驗苗種培育變態與采苗成功率。
參考文獻
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1、來源：南方水產網、南方水產微信公眾平臺
2、作者：湛江市水產學會
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